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Princípios da criopreservação de células


Esta semana falaremos sobre os princípios da criopreservação das células de mamíferos. Sabe-se que o resfriamento reduz o metabolismo celular, mas não o abole de modo que as células continuam a se deteriorar progressivamente, entretanto, em menor velocidade. Por esse motivo, em determinadas situações, é necessário congelar as células a temperaturas capazes de interromper as suas vias metabólicas e mantê-las armazenadas nessas condições até o momento do seu uso.1


No processo de congelamento, há um declínio contínuo e progressivo da temperatura associado à cristalização da água, o que leva ao aumento da concentração dos solutos extracelulares. Por isso, se a velocidade de congelamento for lenta, a célula se desidrata. Por outro lado, se a velocidade de congelamento for rápida, ocorre a formação de cristais de gelo intracelulares e, consequentemente, pode haver lesão celular mecânica. Ambos os casos podem determinar a morte celular, de modo que se deve buscar a velocidade de congelamento ideal, em que a taxa de sobrevivência será máxima, para cada tipo celular em condição específica, visto que, outros fatores, como por exemplo a concentração celular e o uso de agentes crioprotetores, também interferem nesse processo.1,2


Os agentes crioprotetores podem ser classificados em: a) penetrantes ou permeáveis, ou seja, que penetram e permanecem no interior das células, até o descongelamento; b) não penetrantes ou não permeáveis, isto é, que permanecem fora das células.1,2 Como exemplos de agentes penetrantes citamos o dimetilssulfóxido (DMSO) e o glicerol. Esses agentes correspondem à pequenas moléculas que formam pontes de hidrogênio com moléculas de água intracelulares o que diminuiu a temperatura de congelação, prevenindo a formação dos cristais de gelo. Como exemplo de crioprotetores não penetrantes citamos o hidroxietilamido (HES) e a dextrana. Eles permanecem no meio extracelular, retirando a água livre e levando à desidratação do espaço intracelular por efeito osmótico. Usualmente são utilizados em combinação com os agentes penetrantes, com os quais possuem ação sinérgica o que possibilita, portanto, a redução da concentração do crioprotetor penetrante e, consequentemente, da sua toxicidade.2


O dimetilsulfóxido (DMSO; Me2SO) é usado na criopreservação de células-progenitoras hematopoéticas (CPH), de concentrado de linfócitos e de plaquetas, não sendo efetivo no congelamento de hemácias ou de granulócitos. O DMSO possui baixo peso molecular, é incolor e inodoro. Possuiu meia vida de aproximadamente 20 horas, metabolização hepática em dimetilsulfona, que tem meia vida aproximada de 72 horas e eliminação renal ou em dimetilsulfeto, que é expirado pelos pulmões por aproximadamente 24 horas, o que confere odor característico ao hálito do paciente. Na criopreservação de células-progenitoras hematopoéticas, a grande maioria dos serviços utiliza protocolos com concentração final de DMSO entre 5 e 10%. Acredita-se que a sua função seja essencialmente coligativa, ou seja, de captura das moléculas de água livre, com consequente redução da quantidade de gelo formada, da diminuição da temperatura e do ponto de solidificação.1


O HES é um polímero modificado da amilopectina3 que não se difunde para o interior das células.1 Seu mecanismo de ação envolve o aumento da viscosidade e o favorecimento da vitrificação (solidificação) do espaço extracelular, o que em associação com um crioprotetor penetrante, reduz a intensidade das lesões provocadas pela desidratação celular e forma uma camada em torno das células, o que as protege da lesão mecânica pelos cristais de gelo formados no espaço extracelular. Usualmente é utilizado em protocolos de criopreservação de células-progenitoras hematopoéticas que objetivam concentrações finais de HES a 5-6% e DMSO a 5%.1 Como o HES é degradado pela amilase, pode haver um aumento transitório dessa enzima, após a infusão de produtos contendo esse agente.3


O agente crioprotetor de escolha para o congelamento das hemácias é o glicerol. Como esse agente é muito tóxico, deve ser removido antes do uso clínico das hemácias congeladas (deglicerolização). Apesar de o congelamento de hemácias ser previsto na Portaria de Consolidação Número 5,5 não há glicerol comercial disponível no Brasil o que inviabiliza a realização desse procedimento.

Até a próxima!

Equipe erytro.

Bibliografia:

1 De Santis GC, Prata KL. Criopreservação de células-progenitoras hematopoéticas. Medicina (Ribeirão Preto) 2009; 42(1):36-47. DOI: 10.11606/issn.2176-7262.v42i1p36-47. Disponível em: http://www.revistas.usp.br/rmrp/article/view/203 . Acesso em: 29 nov. 2020

2 Dalcin L., Lucci CM. Criopreservação de embriões de animais de produção: princípios criobiológicos e estado atual. Rev. Bras. Reprod. Anim. 2010; 34(3):149-159. Disponível em www.cbra.org.br

3 Oliveira LCO., De Santis. G.C. Outros Produtos. In: Covas DT, Ubiali EMA, De Santis GC, editores. Manual de Medicina Transfusional. São Paulo: Atheneu; 2ª ed. 2014. P41-46.

4 Wagner SJ. Whole Blood and Apheresis Collections for Blood Components Intended for Transfusion. In. Fung M.K., Eder A.F., Spitalnik S.L., Westhoff C.M. Technical Manual. Bethesda: AABB. 19th ed. 2017. P125-160.

5 Portaria de Consolidação nº 5 de 28 de setembro de 2017, disponível em https://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2018/marco/29/PRC-5-Portaria-de-Consolida—-o-n—5–de-28-de-setembro-de-2017.pdf , acesso em 30/11/2020

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